什么是近红外光谱仪 及其选购指南 星枫仪器
王玺 卢红梅
摘 要：基于普洱茶的近红外光谱，选择标准正态变换（SNV）对光谱进行有效的预处理，再结合偏最小二乘回归（PLSR）建立茶多糖近红外光谱定量模型，实现快速检测普洱茶中茶多糖的含量。该模型的交互验证均方根误差值、预测集均方根误差值和预测集相关系数分别为0.0822、0.1264和0.8217。结果表明利用近红外光谱技术结合PLSR可以预测普洱茶中茶多糖的含量，为普洱茶的品质分析和活性成分测定提供一些参考。
关键词：普洱茶；茶多糖；近红外光谱；偏最小二乘回归
云南普洱是一种畅销国内外市场的中国特有茶。它[1]是由云南特有的大叶种晒青茶为原料，在微生物的酶促作用和湿热作用下进行加工工艺而制成的。普洱茶与红茶、绿茶、白茶等其他茶类的主要区别在于它特殊的后发酵工艺。在微生物参与的后发酵过程中，茶叶中的化学物质发生了一系列的显著变化，从而形成普洱茶独特的品质风味和保健功能。近年来，普洱茶越来越受到了消费者和科研工作者的关注，成为茶学领域中的研究热点。
普洱茶的品质、风味以及保健药理功能[2]与茶叶内活性成分茶多糖的组成有很大的相关性。茶多糖是一种复合型杂多糖[3]，具有降血糖、血脂、血压、防治心血管疾病等作用，同时在抗凝血、防血栓、保护血相和增强人体非特异性免疫功能方面均有明显效果。近些年科学研究报道[4]茶多糖还具有治疗糖尿病的功效。因此茶多糖的含量也成为鉴定普洱茶品质的一个重要指标。传统测定茶多糖的方法为苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和高效凝胶液相色谱[5，6]等等，但是这些方法都比较繁琐、工作量大、抗干扰能力较差，并不适合茶叶流通过程中的快速检测。因此为了解决这个问题，有必要提出一种快速、无损、经济的方法定量分析普洱茶中的茶多糖含量。
近红外光谱以其分析速度快、样品无损害、结果重现性好并且分析过程中不需要化学试剂等优点得到越来越多科学家的关注和青睐，因此广泛地被应用于很多领域，比如农业、食品行业以及中草药领域[7，8]等。目前国内外学者先后利用近红外光谱定量分析茶叶中茶多酚、蛋白质、氨基酸、生物碱[9，10]等等，但是专门针对普洱茶中茶多糖含量的应用研究还很少，所以在本文中，基于近红外光谱，选择合适的光谱预处理方法，结合偏最小二乘回归建立普洱茶中茶多糖含量快速、无损的预测模型，为普洱茶中的活性成分研究提供参考价值。
1 理论部分
1.1 偏最小二乘回歸
偏最小二乘回归（Partial Least Square Regression，PLSR）[11]是一种能同时考虑矩阵X和向量y信息的多元回归方法，是目前在近红外建模定量分析中应用最广，并且建模效果较好的多元校正方法之一。首先，PLSR对光谱矩阵X和浓度向量y同时压缩分解，得到一系列包含绝大多数样本信息的主成分，并通过交叉验证选出最佳主成分数；其次将X和y的得分矩阵作多元线性回归，建立预测模型。因此，PLSR模型可以在X矩阵中找到最佳的变量，用来预测y向量中潜在的变量，并充分地考虑两者之间的相关性，使之预测能力很强。
1.2 近红外光谱的预处理方法
光谱预处理方法[12]是近红外光谱应用中非常普遍的一种手段。由于采集近红外光谱时，伴随着随机噪声、基线漂移、样本颗粒大小以及光散射等外界因素，因此近红外光谱测量存在不稳定性，光谱需要进行预处理。常用的光谱预处理有多元散射校正（MSC）、标准正态变换（SNV）、微分（Derivative）和平滑（Smoothing）。下面将逐一进行简单介绍。
多元散射校正（Multiplicative scatter correction，简称MSC）：通过数学方法将光谱中的散射光信号与化学吸收信息进行分类，并假设散射系数在所有波长处均相同。经过散射校正后得到的光谱数据可以有效地消除光散射的影响，增强与成分含量相关的光谱吸收信息。MSC主要用来消除颗粒分布不均匀以及颗粒大小差异所造成的散射影响。
标准正态变换（Standard normal variable，简称SNV）：SNV校正认为每一个光谱中，各波长点的吸收值满足一定的分布（如正态分布），通过这一个假设对每一条光谱进行校正，利用原光谱减去该光谱的平均值后，再除以该光谱数据的标准偏差。它的目的与MSC相似，主要用来消除固体颗粒大小、表面散射以及光程变化对光谱所造成的影响。
微分算法（Derivative）：微分可以消除基线偏移或平缓背景干扰的影响，使原有光谱的分辨率提高。一阶微分能够去除与波长无关的基线漂移，消除光谱平移误差，强化谱带特征，克服谱带重叠。常用的微分方法有直接差分法、窗口移动多项式最小二乘拟合法（Savitzky-Galay），本章采用S-G一阶求导预处理方法。
平滑算法（Smoothing）：平滑是分析信号预处理中消除噪声最常用的一种方法。由于受到外界各种因素的干扰，得到的光谱既包含有用信息，同时也叠加了随机误差（噪声），造成光谱信号的毛糙，往往需要经过平滑预处理来降噪声。最常用的平滑方法为窗口移动多项式最小二乘拟合法，这种拟合方法既能去噪提高光谱的信噪比，又能较好地保持分析信号中的有用信息，将真正的谱峰信号从噪声中提取出来。
1.3 模型评价参数
对建立的模型需要通过测试样本的预测来评价该校正模型的质量，本文将采用如下指标来进行评价：RMSECV、RMSEC和RMSEP（均方根误差），Rcal、Rpre（相关系数）。PLSR模型通过交叉验证过程中最小的RMSECV数值决定最佳主成分的个数。参数的详细公式如下：
（1）均方根误差
交叉验证均方根误差（RMSECV）：该指标主要用于评价建模方法的可行性及所建模型的预测能力。
这三个数值越小，表示建模效果就越好。
（2）相关系数
相关系数R是指y的总波动情况，表示直线关系中预测的数值和实际测量值之间的相关程度。通常R值越接近于1，说明预测值与实际测量值之间的相关程度越好。相关系数计算公式如下：
2 材料与方法
2.1 样品和试剂
40个普洱茶样本自普洱市。茶叶经过粉碎、过筛、置于自封袋，然后在避光、干燥、室温的条件下保存。苯酚和浓硫酸购自国药控股股份有限公司。葡萄糖购自Sigma公司。
2.2 茶多糖的提取和测定
根据文献参考[13]进行优化，本章采用超声提取的方法。以蒸馏水作为提取溶剂，料液比为1：15，超声时间为40min，超声温度为50℃。超声完成后，抽滤取其上清液，将其定容到25mL的容量瓶中。取2ml溶液加入10ml无水乙醇，摇均，过夜醇降静置，离心（4000rpm/min）30min，弃去上清液，沉淀加蒸馏水水溶解，转移至10ml容量瓶中。
配置1mg/ml的葡萄糖标准溶液，作为对照品溶液。将其稀释至不同的浓度，使得葡萄糖的线性范围在10、20、30、40、60、80、100？滋g/ml范围内。
本章采用苯酚-硫酸法[14]测定茶多糖。首先精密吸取1ml样品溶液和空白置于10ml具塞试管中，加入5%苯酚溶液1.0ml，涡旋30s摇匀，再加入浓硫酸5.0ml，立即涡旋30s，使其充分混匀，置于90度沸水浴中加热20min，取出，再放在冷水浴中冷却5min，在485nm处测定吸光度。以葡萄糖作为标准品，茶多糖的含量表示为%GE（每100克茶叶相当于多少克葡萄糖）。
2.3 近红外光谱的获取和光谱分析
由于待测样品为不透明粉末，样品厚度及透射过程中光路的不规则影响透射光谱强度，因此很难获得良好光谱效果。本实验采用漫反射方式测量其光谱。实验仪器为AntarisⅡ FT-NIR Analyzer的近红外仪器（序列号AHY0800344），采集条件：扫描范围为10000-4000cm-1（1000-2500nm）、扫描次数为32次、灵敏度为8cm-1、变量个数为1557。具体的实验过程如下：取0.5000g样品粉末置于样品槽，将其进行压缩、关盖、扫描，同时为了提高准确度，每个样本扫描三次，取其平均光谱进行后续分析。所获得普洱茶的近红外原始光谱见图1所示。
3 结果与讨论
3.1 样本集的划分以及实测值的分布
本章共选用了40个样本建立茶多糖的定量分析模型。在建立模型之前，需要从这40个样本中选择合适的样本作为训练集来建立模型，剩下的样本作为预测集来验证模型的预测能力。本文选择Kennard-Stone样本划分方法，其中28份样本作为训练集，剩下的12份样本作为预测集。所有样品经过光谱采集后，按照上述方法测得其茶多糖的含量。其测量值范围、平均值、标准偏差的结果如表1所示。实验结果显示，普洱茶样品中茶多糖含量的变幅较大，说明样品间差异显著。同时，训练集中各个训练集中数值几乎覆盖了预测集中测量值的变化范围。因此，所选的样品具有代表性，在样品集中的分布是合理的。
3.2 近红外光谱预处理方法的选择
近红外光谱仪所采集的光谱除了样品的有用信息外，还包含了很多其他无关的信息如环境、样品的背景干扰和杂散光等，这些会造成原始光谱基线漂移、谱带重叠，不能充分地反映樣品的信息。因此，为了获得稳定、可靠的模型，首先需要对原始光谱进行预处理，消除数据中的无关信息。本文选择平滑、多元散射校正、标准正态变换以及它们的组合，这些光谱预处理方法，同时以交互验证均方根误差（RMSECV）作为衡量标准。从表1-2可以看出，对于茶多糖，最佳的光谱预处理方法为SNV。
3.3 近红外定量分析模型的建立
本实验采用NIRS-PLS建立普洱茶中茶多糖的定量分析模型。根据3.2选择合适的预处理方法，建立校正模型。其评价结果如下图1-2所示。从图1-2可以看出，茶多糖总量模型还行，可以满足定量模型预测的需求，其中训练集的相关系数为0.9051，预测集的相关系数为0.8217。
4 结束语
本文主要针对普洱茶中茶多糖这个指标建立近红外光谱分析模型，为实现快速、无损检测普洱茶中茶多糖的含量。实验结果表明：针对普洱茶的近红外光谱图，采用SNV光谱预处理手段，可以有效地消除导致光谱变化的外在影响，然后结合PLS进行回归，建立茶多糖总量的预测模型。该模型训练集和预测集的相关系数分别为0.9051和0.8217，RMSEC和RMSEP分别为0.0822和0.1264。这个数据基本可以满足定量分析，但是在以后的研究中可以选择一些变量筛选方法比如CARS、MC-UVE、GA等进一步对大数据进行优化分析，提取更多有效的变量，来提高模型的预测能力。总而言之，近红外光谱技术可以作为一种快速、方便、可靠的方法实现对普洱茶中茶多糖含量的分析和快速检测，为普洱茶的品质分析提供一定的参考价值。
参考文献
[1]Lv H-p， Zhang Y-j， Lin Z， et al. Processing and chemical constituents of Pu-erh tea： a review[J]. Food Research International， 2013，53（2）：608-618.
[2]Jie G， Lin Z， Zhang L， et al. Free radical scavenging effect of Pu-erh tea extracts and their protective effect on oxidative damage in human fibroblast cells[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006，54（21）：8058-8064.
[3]Chen H， Wang Z， Qu Z， et al. Physicochemical characterization and antioxidant activity of a polysaccharide isolated from oolong tea[J].European Food Research and Technology，2009，229（4）：629-635.
[4]陈海霞，谢笔钧.茶多糖对小鼠实验性糖尿病的防治作用[J].营养学报，2002，24（1）：85-86.
[5]林剑军，秦菁莉，周平.黄金茶多糖含量的测定[J].大理学院学报，2009，8（6）：18-19.
[6]崔宏春，周铁峰，郑旭霞，等.茶多糖检测方法研究进展[J].杭州农业与科技，2014（6）：29-31.
[7]Dong W， Ni Y， Kokot S. A near-infrared reflectance spectroscopy method for direct analysis of several chemical components and properties of fruit， for example， Chinese Hawthorn[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2013，61（3）：540-546.
[8]Li W， Wang Y， Qu H. Near infrared spectroscopy as a tool for the rapid analysis of the Honeysuckle extracts[J].Vibrational Spectros
copy， 2012，62：159-164.
[9]Schulz H， Engelhardt U， Wegent A， et al. Application of near-infrared reflectance spectroscopy to the simultaneous prediction of alkaloids and phenolic substances in green tea leaves[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47（12）：5064-5067.
[10]Luypaert J， Zhang M， Massart D. Feasibility study for the use of near infrared spectroscopy in the qualitative and quantitative analysis of green tea， Camellia sinensis （L.）[J].AnalyticaChimicaActa，2003，478（2）：303-312.
[11]Barker M， Rayens W. Partial least squares for discrimination[J]. Journal of chemometrics，2003，17（3）：166-173.
[12]Blanco M， Coello J， Iturriaga H， et al. Effect of data preprocessing methods in near-infrared diffuse reflectance spectroscopy for the determination of the active compound in a pharmaceutical preparation[J].Applied spectroscopy，1997，51（2）：240-246.
[13]楊泱，杨新河，易恋，等.超声波法提取普洱茶多糖的研究[J].中国茶叶，2009（10）：20-22.
[14]武晓英，侯冬岩，回瑞华.黑茶中茶多糖含量的测定[J].鞍山师范学院学报，2011，13（2）：36-38.
