...废水的鱼类急性毒性效应研究
张云飞 王茗 刘华倩 刘亚琦 王莉
摘 要：本试验的试验鱼为草金鱼，通过采用静水式试验，研究了十二烷基苯磺酸钠（LAS）对草金鱼的急性毒性影响；并在急性毒性试验的基础上，研究了亚急性条件下LAS对草金鱼肝脏组织超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响，初步探讨了LAS对草金鱼的毒性效应。LAS对草金鱼的急性毒性试验结果表明，在水温（15.0±1.0）℃条件下，LAS对草金鱼的毒性较强，24h，48h，72h，96h的半致死浓度（LC50）分别是12.2mg/L，9.8mg/L，8.8mg/L，8.6mg/L。在LAS浓度为2.2，2.9，3.6，5.7，7.9mg/L的亚急性条件下暴露96h，试验结果表明，LAS质量浓度低于3.6mg/L时，LAS对肝脏中SOD酶活性表现出激活作用；LAS浓度高于3.6mg/L时，LAS对肝脏中的SOD酶活性表现出抑制作用。
关键词：草金鱼；十二烷基苯磺酸钠；半致死浓度；超氧化物歧化酶（SOD）
随着经济发展，人们生活水平的提高，各种洗涤剂被广泛应用于工业、农业、医药等领域，每年消耗量巨大。洗涤剂的重要组成成分是表面活性剂，十二烷基苯磺酸钠（LAS）是目前使用最普遍的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠（LAS）随着生活污水和工业废料等大量排入自然水体，造成水生生物不能正常生长，破坏了水体环境的生态平衡。十二烷基苯磺酸钠（LAS）作为水体中的常见污染物，已被列为《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB18918-2002）的基本控制项目。尽管十二烷基苯磺酸钠（LAS）在水体中易生物降解，但是LAS在环境中的吸附、沉淀和生物降解等迁移行为十分复杂。已有研究表明，LAS在环境和生物体内有累积，在低浓度条件下对鱼类产生慢性毒性。河流和湖泊中的表面活性剂污染十分严重，对渔业和人们的生活健康具有潜在危害。因此研究阴离子表面活性剂（LAS）对鱼类的毒性效应十分必要。
水生生物毒性试验在研究水体中化学污染物的环境效应方面有着重要作用。鱼类作为对水中发生的各种物理、化学和生物性的变化反应十分灵敏的一种水生生物，是水生生物毒性试验经常选取的受试对象之一。表面活性剂对鱼的急性毒性研究和对鱼的各项生理指标的影响不断被报道，研究结果表明表面活性剂对鱼类有较大毒性，会对鱼的生理指标产生影响[1-2]。目前，从分子水平研究水中污染物对鱼体内酶、蛋白质等生化反应的影响，用于判断污染物对鱼的毒性作用和探究污染物对鱼的致毒机理成为毒性试验研究的新方向[2-5]。超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内重要的抗氧化酶，其主要作用是清除生物体内的自由基。它通过催化反应2O2-+2H+→H2O2+O2可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢，随后过氧化氢被体内的过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）立即分解为无害的水。超氧歧化酶（SOD）其活性随污染物的胁迫作用而发生改变，可以间接反映环境中有毒有害物质对鱼的毒性效应[5]。目前，阴离子表面活性剂（LAS）对鱼的毒性研究选取的鱼有草鱼、彭泽鲫等，但是陰离子表面活性剂（LAS）对具有一定观赏价值，经济效益高的草金鱼的毒性研究还鲜见报道。
因此，本研究以草金鱼为试验对象，通过急性毒性试验研究LAS对鱼类产生毒害作用的表现，找出产生不良影响的阈浓度。为进一步研究阴离子表面活性剂对草金鱼的毒性机制，本试验以SOD活性变化为评价指标，通过采用暴露实验法，研究在亚急性条件下阴离子表面活性剂对草金鱼肝脏组织中SOD活性的影响，目的是为了利用鱼体内的酶活性变化来评价阴离子表面活性剂对水生生物的毒性效应，为水环境中该类化合物污染的早期预报和防治提供参考依据。
1 试验材料与方法
1.1 试验材料
本试验受试鱼为草金鱼，从郑州市荥阳市王村镇北黄河滩养殖场购买，平均体长为3.4cm，平均体重为1.2g。试验用的草金鱼是从养殖场运到实验室的鱼苗，首先用自来水将鱼苗驯养7天，自来水需经曝气脱氯24h才能使用。驯养水温为（15±1.0）℃（预试验与正式试验水温与驯养时相同），pH为7.0～8.0，溶解氧为9.0mg/L，驯养水水质符合鱼的生活水质要求。驯养期间需喂食和换水。喂食频率为两天一次，定时喂取，换水频率为一天一次。期间及时清理鱼屎并捞出死鱼。试验前1d和试验期间不再喂食和换水。
试验所用表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠，纯度为分析纯，分子式C18H29NaO3，相对分子质量348.48，天津市凯通化学试剂有限公司。SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所，LAS测定方法采用混合指示剂程序加入法（MIST法）。
1.2 试验方法
1.2.1 急性毒性试验
正式试验前应首先进行预备试验[6]，根据预备试验方法确定鱼的全存活和全致死LAS浓度，从而确定试验浓度的大致范围。由预试验确定的浓度范围，设置6个质量浓度5.2，5.9，7.0，8.4，9.8，13.2mg/L及1个空白对照（CK）0.0mg/L，设置7个鱼缸，每个鱼缸随机放置10条草金鱼，时间为96h，鱼缸为玻璃缸。
试验期间，每天两次定时测定试验数据，详细观察草金鱼中毒时的症状和活动情况并记录。在试验开始的24，48，72，96h分别记录试验草金鱼的死亡数（是用捞鱼的网触碰鱼，无反应即可判定为死亡），根据草金鱼的死亡率，用直线内插法求出半致死浓度。
1.2.2 LAS对SOD活性影响试验
采用静水式试验，根据96h半致死浓度（LC50），将LAS质量浓度设置为0.0，2.2，2.9，3.6，5.7，7.9mg/L共6个梯度，每个浓度梯度设3组平行样，共18个鱼缸，每个鱼缸放鱼数量和方式与急性毒性试验相同，试验时间为96h。
1.2.3 SOD活性的测定
在试验开始96h后，捞出鱼缸内活鱼杀死，迅速将鱼的肝脏组织取出，放入冰冷的生理盐水中洗净血液，再用滤纸吸干水分。准确称取组织重量，按照重量（g）：体积（ml）=1：9的比例加入9倍体积的生理盐水，剪碎组织，在研钵中充分研磨制备匀浆。以3000r/min的转速用离心机离心10min，取上清液即10%匀浆上清液测定SOD。SOD活性的测定采用SOD试剂盒及酶标仪介绍的方法。在本反应体系中，SOD以每毫克组织中SOD抑制率达50%时所对应的酶量为一个SOD活力单位（U），即U/mg组织。
2 结果分析
2.1 急性毒性试验结果
对草金鱼的急性毒性试验表明，水中的LAS质量浓度越高，草金鱼的中毒现象越明显，死亡的速度越快数量越多。试验开始时，鱼缸内的鱼表现出不同的活动情况，一部分鱼活动迟缓，另一部分鱼易受惊吓在鱼缸内乱窜。随着中毒时间的延长，一部分鱼游动出现倾斜的情况，逐步丧失活动能力，活动进一步迟缓，即使用网去触碰也不躲避；另一部分鱼则出现发颤的情况，游动过程中身体摇动不止。高浓度区的草金鱼慢慢停止活动，直至死亡。
表1记录了LAS对草金鱼急性毒性试验的致死数据和LAS对草金鱼的半致死浓度。以LAS的质量浓度为横坐标，草金鱼的死亡率为纵坐标绘制死亡百分率对试验物质浓度的曲线，该曲线为一条S形的关系曲线，从引起50%死亡率的内插浓度值得到值。由表1可知，LAS对草金鱼24h，48h，72h，96h的半致死质量浓度分别为12.2mg/L，9.8mg/L，8.8mg/L，8.6mg/L，LAS对鱼表现出较强的毒性。表面活性剂是一种可溶特殊的脂类化合物。其分子结构一端为亲水基团，一端为疏水基团，因此具有亲水性和亲脂性。程吕柏[7]等认为，LAS分子引起动物细胞死亡的原因主要是破坏了细胞膜。细胞膜的破坏作用包括以下两个方面，一是LAS分子中的疏水基团长碳氢链部分容易插入细胞膜的磷脂双分子层引起膜结构的损伤，二是十二烷基苯磺酸钠（LAS）中的苯磺酸根离子易与细胞膜上的蛋白质结合，改变膜蛋白质的构象或导致蛋白质变性，使膜的通透性改变。
2.2 LAS对草金鱼肝脏中SOD酶活性的影响
由表2可知，肝脏组织中SOD酶活性在LAS质量浓度为3.6mg/L时影响显著。LAS质量浓度低于3.6mg/L时，肝脏组织中SOD酶活性高于空白组的SOD酶活性。LAS质量浓度高于3.6mg/L时，肝脏组织中的SOD酶活性迅速降低且低于空白组的SOD酶活性。雷鸣[2]等研究结果表明，LAS用量低于4.0mg/L时，LAS对彭泽鲫鳃、肝脏组织中SOD具有激活作用；LAS用量不低于4.0mg/L时，LAS对彭泽鲫鳃、肝脏组织中SOD活性的影响却表现出抑制作用，这与本试验结果相近。
LAS质量浓度低于3.6mg/L时，由试验组和空白组的酶活力值对比结果可知，LAS肝脏中SOD酶活性得到提高。这是因为十二烷基苯磺酸钠（LAS）对草金鱼的细胞造成伤害，产生高于正常值的超氧自由基，为了维持细胞的正常生理功能SOD酶提高活性以清除多余的超氧自由基。但是SOD酶消除能力是有限的，且其正常发挥功能必须满足酶蛋白结构不被破坏。LAS质量高于3.6mg/L时，草金鱼肝脏中产生的超氧自由基过多，超出了SOD酶的消除能力，同时酶蛋白结构被破坏，SOD酶功能受损，SOD活力降低甚至为零。随着LAS浓度的增加，SOD酶活性这种抑制作用也加强。LAS对草金鱼肝脏有较大伤害作用，且能够在肝脏中累积。
李伟民、丁诗华[8]等研究结果表明，生物受到轻度逆境胁迫时，抗氧化酶活性往往升高，但受到重度逆境胁迫时，抗氧化酶活性通常降低，这与本试验中草金鱼受到LAS单一污染时SOD变化规律基本一致。已有研究表明，采用阴离子表面活性剂（LAS）作为单一污染物对水生动物进行毒性试验时，可使有机体产生活性氧，进而导致水生动物体内的抗氧化酶活性或含量发生改变，因此污染物作用下水生动物体内产生活性氧造成氧化损伤可能是污染物致毒的重要途径。超氧化物歧化酶（SOD）参与生物体内活性氧的清除，对生物机体起着重要的保护作用。超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化与污染物浓度呈现相关性，并且其活性变化在一定程度上能够反映污染物对生物体的毒性效应[9]。
3 结论
通过急性毒性试验，得出阴离子表面活性剂LAS对草金鱼的24h，48h，72h，96h的半致死浓度（LC50）分别是12.2mg/L，9.8mg/L，8.8mg/L，8.6mg/L。阴离子表面活性剂LAS对草金鱼表现出较强的毒性。在LAS浓度为2.2，2.9，3.6，5.7，7.9mg/L的亚急性条件下暴露96h，试验结果表明，LAS质量浓度低于3.6mg/L时，LAS对肝脏中SOD酶活性表现出激活作用；LAS浓度高于3.6mg/L时，LAS对肝脏中的SOD酶活性表现出抑制作用。从LAS对草金鱼肝脏SOD活性影响来看，SOD的活性先增高后降低说明阴离子表面活性剂（LAS）污染会使草金鱼体内的多种生化过程受到影响。将超氧歧化酶（SOD）作为水生生物在受到表面活性剂污染胁迫的毒理学指标具有一定的可行性。
参考文献
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作者简介：张云飞（1995-），男，郑州大学水利与环境学院学士，从事水环境治理方向研究。
*通讯作者：王莉（1973-），女，河南开封人，高级工程师，郑州大学水利与环境学院，主要从事水环境治理与水生态修复研究。
