...a 等发现新 CRISPRCas系统,已提交临时专利申请 原创网站设计
李志远+熊东彦+慕昕
摘 要：CRISPR技术是近年来兴起的继锌指核酸酶和TALENs技术的第三代基因编辑技术，相比于之前的两种人工核酸酶，其具有许多无可替代的优势，并已在多种动植物中应用。文章就CRISPR系统的发现、分类、作用机制以及其优缺点和对外來应用的展望做综述介绍。
关键词：CRISPR机制；结构；脱靶
前言
基因编辑指对目标基因进行敲除、替换和插入的遗传操作。最近几年来基因组定点编辑技术包括人工核酸酶即锌指核酸酶、TALENs[1]、CRISPR/Cas系统。锌指核酸酶是非特异性核酸酶ForkI的切割结合域与有串联锌指结构的锌指蛋白融合成的人工核酸酶，串联锌指结构可特异性的结合DNA序列前者使DNA双链断裂，产生双链断裂。TALENs可以与DNA特异性的识别。其也由非特异性核酸酶Fork I和TALE融合而成。要指出的是，以上二者均会产生双链断裂，而基因组双链断裂时，会发DNA损伤修复机制，包括DNA双链断裂末端直接连接，其常常会造成连接处碱基突变，如果人为的将缺失部位设置在外显子上，可造成移码突变，实现基因敲除；若利用同源重组，人为加入含同源臂外源DNA，经同源重组，将外源同源片段添加到基因组上，即引入了外源基因片段。
CRISPR系统是新兴起来的一种基因编辑技术，它存在于细菌，类似获得性免疫。并在多种动植物中得到了应用，本文主要从其历史、机理、发展和应用前景作出综述。
1 CRISPR/Cas系统的发现和发展
最早日本科研组于1987年发现大肠杆菌碱性磷酸酶基因附近存在串联间隔重复，之后发其广泛存在于细菌和古细菌基因组[2]，零二年首次将其命名为CRISPR。零五年，发现CRISPR的间隔序列和细菌内一些染色体外的遗传物质高度同源，因此推测，这可能与细菌抵抗外源基因入侵有关。零六年，利用生物信息学分析，其可能以类似RNAi的方式行使功能。零七年，发现细菌可能利用其抵抗噬菌体的入侵，零八年，又发现细菌可以利用其抵抗外源质粒的转化。至今其功能越来越清晰，重要性也越来越清晰。
2 CRISPR的结构和分类
其首先包含间隔序列和重复序列，其中，间隔序列高度可变，主要来源于噬菌体和质粒，长度在20～70bp，不同的基因座之间的间隔序列的数目不同，这样，我们或许可以分析基因座中间隔序列的种类及时间序列，来考虑不同菌的亲缘关系。而重复序列，也非保守，其长度一般为20～50bp，但是其两端相对保守，间隔序列与重复序列间隔排列，且重复序列中还存在保守回文结构。
之后，人们发现，在其基因座附近还有一些保守的蛋白质基因，即Cas基因，这些基因编码了包括核酸酶、解旋酶、聚合酶以及与RNA结合的结构域。并非每一个CRISPR基因座附近都有相应的Cas基因，但这种产物也可以通过和其他位置的Cas基因编码的蛋白质结合，从而发挥作用。
现目前应用最多的为两类，其中，前者含有Cas3蛋白，它具有解旋酶和核酸酶的功能，此系统中多个Cas蛋白与成熟的crRNA结合形成病毒防御复合体，结合外源DNA，形成R环结构，Cas3的核酸酶活性识别R环结构后切开互补链，再通过解旋酶活性和核酸酶活性将非互补链切开。后者含有Cas9蛋白，其参与crRNA的成熟和外源质粒的降解。其存在于细菌中，因为只需要一个Cas参与外源基因剪切，故更为方便。
3 作用机制
其作用机制可以分为三个步骤[3]：
（1）获取新的间隔序列。
（2）将新引入的原间隔转录。
（3）和Cas蛋白形成复合物精准作用入侵基因座。最后一种应用最多，因为其只需要Cas9参与剪切。其有2个核酸酶结构域：氨基端结构域和中间位置的核酸酶结构域，核酸酶结构域可以切割与前转录物互补配对的模板链，切割位点位于PAM上游，氨基端结构域可对另一条链进行切割，切点位于PAM上游。在前转录物与tracr RNA形成的双链RNA的指导下，Cas9蛋白将靶点切割[4]。
4 脱靶问题
脱靶即对基因组非特异性切割。理论上该系统脱靶的概率会较高，特别是最近有科研组发现在人类中，最多存在五个错误碱基的情况下，系统仍然会对该位点进行切割，造成脱靶。因此系统特异性的提高十分重要，主要有以下措施[5]：
（1）突变核酸酶的氨基端结构域或中间核酸酶结构域，使其变为切口酶，在不引起非同源末端连接修复机制前提下激活同源重组修复机制，降低细胞毒性。
（2）利用生物信息学手段对其同源蛋白进行预测，寻找高特异性核酸酶。
5 优势及应用前景
（1）靶向精准性高，其可以经改造为切口酶，不会引起非同源末端连接，但同源重组机制仍可被激活，故可以作为切口酶来实现目的基因的定点敲入或点突变，大大降低非同源末端连接的风险和脱靶效应。
（2）可对靶基因多个位点同时敲除：其靶位点很短，故可串联若干向导RNA，以同时编辑同一个基因不同位点，这可以用于研究同一基因家族不同基因功能以及基因之间的相互作用。
（3）在基因编辑上有灵活性，在Cas9蛋白末端添加其它功能性蛋白，如添加转录激活域，则可激活靶基因表达；若添加甲基化酶，可以进行靶位点甲基化调控，有助于表观遗传学调控研究。
（4）靶点在基因组中数量众多，在平均间隔8bp。
6 结束语
综上，CRISPR/Cas9技术是一种强大的基因编辑工具，将在基因功能注释、基因治疗、靶向药物、人类疾病动物模型创制起到强大作用，且其具有设计简单、耗时短、节约成本、实验操作性强等优势，故必将成为普通生物学实验室的常用技术。
参考文献
[1]Huang P， et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol， 2011，29（8）：699-700.
[2]Jansen R， et al. Identification of a novel family of sequence repeats among prokaryotes. Omics： a Journal of Integrative Biology， 2002，6（1）：23-33.
[3]Wiedenheft B， et al. RNA-guided complex from a bacterial immune system enhances target recognition through seed sequence interations. Proc Natl Acad Sci USA， 2011，108（25）：10092-10097.
[4]李君，张毅.CRISPR/Cas系统：RNA 靶向的基因组定向编辑新技术[J].遗传，2013，35（11）：1265-1273.
[5]方锐，畅飞，孙照霖，等.CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J].生物化学与生物物理进展，2013，40（8）：691-702.
作者简介：李志远，就读于东北农业大学生命科学学院，研究方向：分子生物学。
