徐凯南++杨笑如
摘 要：本实验通过添加不同溶度的次氯酸钠溶液，与不加次氯酸钠溶液作为空白对照，研究得出在保证不影响杂交构树正常分化生长的前提下，杂交构树诱导和扩繁培养基的最佳添加浓度均为10mg/L。在很大程度上解决了杂交构树在开放式组培中的难题，为杂交构树下在开放情况下创造了条件，简化了操作环节，有利工厂化生产。
关键词：杂交构树；组织培养；快繁技术；开放式组织
杂交构树是近年中科院极力推广的一种优良速生树种，是科学家通过传统的杂交育种结合现代生物技术手段培育而得。具有抗逆性性强，耐干旱、贫瘠、盐碱等优良特性，它的全身都是宝，叶、皮、果等都可以利用，有“未来软黄金”的美称。目前杂交构树的种植主要通过插扦，但是插扦的成活率极低，选择在较好的时间段，成活率高的杂交构树嫩芽，配合生根粉进行插扦，成活率也只有24%[1]。而通过无菌操作组织培养不仅可以大大提高育苗的速度，使育苗不受季节限制，同时组培苗的生根率也高达100%。但污染和繁琐的组培程序是阻碍组织培养走向工厂化的关键问题。开放式组培的研究具有重大的意义，它可以在不影响组培效果的前提下抛开无菌操作，简化环节，降低成本，为植物组织培养及工厂化育苗提供新的可能。次氯酸钠做为一种广谱性抑菌剂，在组织培养细菌、真菌的污染与预防和香蕉开放式组培中都取得了不错的效果[2]。本试验采用抑菌剂次氯酸钠，研究在不同浓度次氯酸钠处理下对杂交构树开放式组培生长的影响，以期简化杂交构树的组培程序，降低成本，为生产提供更好的服务。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验用杂交构树引种自中科构想（北京）林业科技有限公司 “中科1号”品系。采用的次氯酸钠纯度为分析纯，由西陇化工股份有限公司生产，次氯酸钠含量（以有效氯计）≥8.0%，游离碱含量（以氢氧化钠计）≤5.0%，试验用的次氯酸钠溶液现配现用。其他药品还有6-BA、NAA、KT、蔗糖等。
1.2 試验方法
1.2.1 数据统计
污染率（%）=污染瓶数/总接种瓶数X100%
褐化率（%）=褐化瓶数/总接种瓶数X100%
存活率（%）=存活瓶数/总接种瓶数X100%
1.2.2 组培塑料杯灭菌处理
鉴于是开放式组培不需要经过高压灭菌，本次实验选取比较方便、易于运输且透光性较好的塑料杯作为接种容器，封口采用奶茶封盖机封口。塑料杯和封口膜使用前统一由外面的工厂用同位素钴60照射消毒，备用。
1.2.3 次氯酸钠最佳实验浓度的实验
诱导分化和增殖扩繁培养基的次氯酸钠浓度均设置为0mg/L（为CK1，未经过高压灭菌）、0mg/L（为CK2，经过121度，20min高压灭菌处理）、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L。接种方法采用开放式，对照组2在超净工作台接种。诱导分化每杯培养基接种2个 芽，每组10杯，处理3组。扩繁培养基每杯接种6个，每组20杯，处理3组。接种完之后30天观察污染、褐化、存活情况，统计最后污染率、褐化率、存活率。
1.2.4 培养基的配制
配制培养基的房间需经过紫外灯30min照射消毒，诱导分化培养基采用MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L+抑菌剂。增殖扩繁培养基采用MS+6BA 2.0mg/L+KT1.0mg/L +GA21.0mg/L+抑菌剂。培养基加热溶解将PH值调到6.0后进行分装，并迅速盖好杯盖，置于已经消毒干净的接种室中冷却凝固待用。
1.2.5 接种环境的营造
接种前一天晚上，打开紫外灯进行消毒，接种前关闭紫外灯，并进行75%酒精降尘处理。
1.2.6 培养环境的营造
培养室定时日光灯照射12h/d，设置温度25±1℃，湿度保持在60%-80%，光照强度2000-3000LX。
1.2.7 开放式接种方法
不借助超净工作台，在已经消毒处理过的接种室内操作台上，取氯化贡消毒后的构树嫩芽于75%酒精擦拭后的接种盘上用剪刀剪去褐化损伤部分，每个接种芽留一个生长点，长度取2-3cm为宜。接种完一瓶后用酒精灯灼烧瓶口后迅速盖上盖子，完成接种。接种用的剪刀、镊子和解剖刀每次使用后用75%酒精擦拭后置于300度消毒器中30秒后取出降温待用。
2 结果与分析
2.1 诱导分化杂交构树分化的最佳浓度
由图1可得，从污染率来看随着次氯酸钠浓度的增加污染率不断下降，在使用大于30mg/L次氯酸钠的时候，污染率低于6.67%，相比较于其他处理组污染率低。从褐化率来看，随着抑菌剂次氯酸钠浓度的提高，褐化率呈不断上升的趋势，使用大于30mg/L次氯酸钠的时候，所有的构树嫩芽都死亡，一方面是因为杂交构树属于木本，本身会分泌多酚导致褐化，另一方面是受到太高浓度次氯酸钠浓度的毒害。使用5mg/L和10mg/L次氯酸钠浓度褐化率分别是36.67%和40.00%，褐化率与CK2相近。从存活率来看，随着抑菌剂次氯酸钠浓度的提高，存活率呈不断下降的趋势，高浓度的抑菌剂浓度（20mg/L-30mg/LNaClO），使得杂交构树的嫩芽的存活率低于6.67%。从总体来看，30mg/L次氯酸钠浓度时，污染率虽然很低，仅6.67%，但确呈现出高褐化率和低存活率。5mg/L和10mg/L的次氯酸钠浓度虽然褐化率相差不大，但10mg/L次氯酸钠浓度污染率和存活率相较于5mg/L时，呈现出更有利的一面，更有利于杂交构树嫩芽的生长。所以次氯酸钠做为杂交构树嫩芽诱导分化的最佳浓度为10mg/L。
2.2 扩繁杂交构树的最佳浓度
由图2可得，从污染率来看，次氯酸钠的浓度越高污染率越低。30mg/L次氯酸钠浓度仅污染率仅5.00%比CK2处理组的还低。从褐化率来看，次氯酸钠浓度的提高，褐化率呈上升趋势，不利于杂交构树的生长，30mg/L次氯酸钠浓度下褐化率高达81.67%。从存活率来看，高浓度的次氯酸钠也不利于构树的存活，30mg/L次氯酸钠浓度下存活率仅为6.67%。从整体来看，10mg/L次氯酸钠处理组要优于其他处理组，存活率达71.67%。所以杂交构树的扩繁培养基次氯酸钠的最佳浓度为10mg/L。
3 讨论
开放式组培的成功试验目前还比较少看到有报道，传统培养基的富营养化常常成为细菌的温床，给开放式组培带来困难，从优化培养基入手，在不影响正常生长的情况下，减少有机物和蔗糖的用量，即可以节约成本又有利于开放式组培的成功构建。近年来研究比较多的是从植物中提取某种具有抗菌的活性物质，在结合添加一点化学药品，制成一种以植物原料为主的广谱性抑菌剂[3]。由于研究一种有效的植物源广谱性抑菌剂所需要的周期是比较长的，所以作者选择使用次氯酸钠作为杂交构树开放式组培抑菌剂来研究。次氯酸钠是含氯消毒剂使用最广的，具有杀菌谱广、作用迅速低毒、价格低，对真菌和芽孢也显著的杀灭效果。
和常规的使用超净工作台进行接种工作相比，本试验通过添加10mg/L次氯酸钠建立的开放式组培可以有效的降低组培成本，首先脫离了超净工作台，就节省了超净工作台耗电费用，根据研究超净工作台耗电就直接占耗电成本的46%[4]，另一方面无菌操作变得没那么严格，也从另一方面提高了工人接种效率[7]。而且添加了次氯酸钠之后培养基就不用经过高压锅灭菌，不但节省了高压锅的灭菌费用，还提高了配制培养基的效率，还减少了对培养基中营养物质的破坏，更有利于植物的生长。诱导培养基加入10mg/L次氯酸钠后，污染率、褐化率、存活率相比较于CK2差别都不是很大。扩繁培养基加入10mg/L次氯酸钠后污染率和褐化率虽然和CK2还存在一点差距，但存活率也达到71.67%，笔者要指出的是本次试验培养基所采用的是传统培养基，没有经过优化处理。如果培养基经达优化之后，构树的组培效果是有可能达到和高压灭菌同样的效果，甚至有可能优于高压灭菌的。
综上所述：次氯酸钠在杂交构树开放式组培中的诱导和扩繁添加的最佳抑菌浓度均为10mg/L，而关于此浓度下是否适合生根培养及培养基如何优化有机物和碳源蔗糖的添加量的试验还有待进一步研究。
参考文献
[1]周鑫.不同处理方式对构插扦效果的影响[J].青海农林科技，2012（1）：8-11.
[2]解辉，莫廷辉，曾丽星.次氯酸钠在香蕉开放式组织培养中的应用研究[J].热带作物，2011，32（5）：886-890.
[3]卢加举，张正学，彭仕荣，等.复合型抑菌剂在甘蔗开放式组培中的应用研究[J].热带农业科学，2012，32（10）：67-71.
[4]高光林，孙英，唐立平.降低植物组培成本的技术研究进展[J].安徽农业科学，2010，38（16）：8296-8297，8302.
作者简介：徐凯南（1990-），籍贯：福建安溪，学历：本科，职称：生物助理工程师，主要研究方向：林业种苗组培。
