污水处理微生物产品是培养纯天然优势菌种
段江南 苏宏 王发艳 杨希
摘 要：利用青海湖裸鲤养殖废水对小球藻进行培养，以及在开放条件下对小球藻生长趋势进行研究，同时筛选土著淡水轮虫品种，为生物饵料的研究提供基础支撑。本研究以BG11标准培养基为基础，在实验室和室内开放条件下添加不同比例的养殖废水，观察小球藻的生长情况及水化学指标，将通过筛绢过滤得到的土著淡水轮虫接种于小球藻内培养，定期用显微镜观察轮虫个体生长情况和数量等参数。结果表明：小球藻能够较好地利用培养基中的氨态氮，添加鱼塘水的培养基培养的小球藻前期长势更好；室内开放条件下，小球藻的生长周期及生物量都明显缩短；分离筛选得到的龟甲轮虫和臂尾轮虫能够正常挂卵，但长期生长状态还需进一步实验研究。
关键词：青藏高原；小球藻；轮虫；叶绿素a；氨态氮
1引言
小球藻（Chlorella）为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，具有丰富的多糖、脂质、蛋白质、叶绿素和一些生物活性物质，营养价值丰富，可作为天然水产饵料，改善水体化学环境条件，起到调节水质的作用，在水产饲料行业有着广阔的应用前景，普遍见于淡水渔业生产[1]。尤其作为培养轮虫的首选饵料，是淡水轮虫大规模生产的重要因素之一[2]。使用小球藻培养轮虫，可优化水质并且提高培养总量，也可以作为一种优质饵料用于轮虫的大规模培养[3]。与天然水产饵料相比，轮虫的蛋白质和粗脂肪含量均优于其它，在适口性、易得性、饲养效果方面都属上等饵料[4-7]。另外，轮虫具有适应性强、繁殖快、容易培养等特点，因而在水产行业多有应用 [8-10]。
在青藏高原水生动物养殖及物种与环境保护方面小球藻并未得到广泛应用。高原特色物种青海湖裸鲤目前仍主要以鸡蛋黄作为开口饵料，这种方法会导致成本偏高，在水体中投放量过多会造成水体污染，从而影响幼苗生长。为解决裸鲤开口饵料问题，本项目将小球藻作为轮虫繁殖的主要营养物质，同时以后期大规模培养为目的，利用鱼塘养殖废水与基础培养基的不同配比为实验手段，探讨适合小球藻大量快速生长的基本条件，为后期工厂化扩培小球藻提供实验基础与理论依据。
2材料与方法
2.1材料
实验用小球藻购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，筛选土著淡水轮虫品种的水样取自青海湖裸鲤救护中心原种场西二鱼塘底层，养殖废水取自青海湖裸鲤救护中心原种场西二鱼塘。
2.2方法
2.2.1不同配比培养基中小球藻生物量的测定方法
通过叶绿素a的含量间接反映小球藻的生物量，测定培养基叶绿素a的含量，用移液枪吸取4 mL小球藻液置于10 mL离心管中，于12000 rpm离心5 min，弃去上清液，加入4 mL 80%丙酮重懸，4℃冰箱中放置过夜。将过夜重悬的藻液于12000 rpm离心5 min，将上清液转移至比色皿中，以80%丙酮作为对照，用紫外分光光度计测定OD663、OD645值，根据下式计算叶绿素a含量，Ca（mg/L）=12.7OD663-2.69OD645。
2.2.2培养基中氨态氮的测定
向7支比色管中分别加入硫酸铵标准使用液0.00，0.10，0.20，0.40， 0.60，0.80，1.00 mL，加水稀释至总体积10 mL，加A试剂、B试剂各1.25 mL（A试剂：5 g苯酚和25 mg二水合亚硝基铁氰化钾溶解、定容至100 mL；B试剂：2 mL次氯酸钠溶液（NaClO）和2.5 g NaOH溶解、定容至100 mL）。于水浴锅中50℃水浴20 min，冷却，测定OD625，绘制标准曲线。水样中氨态氮含量的测定：取水样15 mL进行抽滤，得到过滤水样，取10 mL过滤水样放入比色管中，加入A试剂、B试剂各1.25 mL，于水浴锅中50℃水浴20 min，冷却，测定OD625，在标准曲线中查出氨态氮的含量。
2.2.3水样初步处理及轮虫筛选分离
将采集到的水样搅拌均匀，使得水样内物体漂浮。取得的水样用80目筛绢进行过滤，用少量暴晒两天的自来水将过滤在筛绢上的物体反复仔细冲洗1-2次，收集冲洗得到的水样，用200目筛绢将水样再次反复在同一200目筛绢上过滤，小心收集筛绢上所过滤得到的物体，用200 mL经暴晒的自来水充分冲洗至250 mL烧杯中。用胶头滴管吸取1-2 mL烧杯中的水样滴加到浮游生物计数框内置于光学显微镜下，先用4倍物镜找到清晰视野观察寻找轮虫；找到后将物镜扩大至10倍调焦至清晰，接着再将物镜转换为40倍调焦至清晰并用拍照留图，之后利用吸嘴前端剪去2-3 mm的2.5 μL移液枪枪头在显微镜下分离轮虫。
3结果与分析
3.1不同配比鱼塘水小球藻生物量及氨态氮含量分析
实验结果表明，BG11/鱼塘水为1：1和1：2的培养基，在1-9天内生物量明显高于BG11培养基（P<0.05），在第9天达到峰值，叶绿素a含量分别为0.617 mg/L和0.710 mg/L，从第9天起进入衰亡期；BG11培养基叶绿素a含量在第24天达最大值1.097 mg/L，与初始叶绿素a含量相比增加0.991 mg/L，日平均生长量为0.041 mg/L，从第24天起进入衰亡期。以叶绿素a为纵坐标，以培养时间为横坐标，绘制小球藻在不同培养基条件下的生长曲线，生长曲线见图1。
小球藻对氨态氮的利用效果较好，三种培养基中氨态氮的初始浓度：1：2>1：1>BG11，且1：2培养基在第6天左右氨态氮含量达到最低值0.013 mg/L，1：1培养基在第9天左右氨态氮含量达到最低值0.034 mg/L，BG11培养基在第9天左右氨态氮含量达到最低值0.044 mg/L。从第10天起，可能存在硝态氮与氨态氮的转化，培养基中的氨态氮含量均有所回升。培养基中氨态氮含量变化情况如图2。
3.2室内开放培养与实验室条件下小球藻生长情况的分析
室内开放培养中叶绿素a的初始含量为0.104mg/L，随时间的变化为0～15 d上升，15 d后急速下降；实验室条件下小球藻的叶绿素a初始含量为0.106 mg/L，随时间变化经历对数期、稳定期、衰亡期，培养周期明显长于室内开放培养。
3.3显微镜下轮虫的筛选分离
通过镜检可发现，青海湖裸鲤救护中心原种场西二鱼塘水中生长有两种不同的轮虫，分别为臂尾轮虫和龟甲轮虫，镜检图见图3、图4。分离过程中发现，臂尾轮虫数量为1只/mL较龟甲轮虫3只/mL少，但个体较大且活性及游动能力很强，未见有其卵存在；龟甲轮虫属于优势种群，但个体较小且活性及游动能力很弱，有挂卵成虫和卵团存在。
4讨论
BG11/鱼塘水为1：1与1：2小球藻的延滞期短，有可能是添加了鱼塘水后有机质丰富，小球藻快速渡过了这一时期，但BG11/鱼塘水为1：1与1：2小球藻的最大生物量和对数生长期不如BG11，可能是由于微量元素的差异。实验表明小球藻对氨态氮的利用效果较好，BG11培养基在第9天左右氨态氮含量达到最低值0.044 mg/L。从第10天起，可能存在硝态氮与氨态氮的转化，培养基中的氨态氮含量有所回升，由此可以看出，小球藻对氨态氮的吸收不是简单的正比关系。
叶绿素a含量变化结合温度变化可知，在室内开放条件下培养的小球藻与实验室条件下培养的小球藻相比，前者的生长时期缩短20天左右，没有延缓期，衰亡迅速，叶绿素a含量差异显著，可能因为所在环境温度不稳定，并且由于敞开培养导致外界生物进入培养体系，对其生长产生影响。
由于轮虫具有生命活性，在浮游生物计数框内会保持游动状态，因此显微镜下分离轮虫时一定要保证目标轮虫始终在视野范围内，用处理过的2.5 μL微量移液枪迅速吸出轮虫后完成转移，转移时应反复吹打移液枪，防止轮虫粘在枪头；用于培养轮虫的小球藻浓度不易过高，保持在105个/mL即可，浓度过高会影响轮虫生长，其原因一方面是小球藻过度生长繁殖造成培养瓶内养分与氧气缺乏，影响轮虫正常生长活动，另一方面是小球藻浓度过高会使取样镜检轮虫的难度增加，不利于观察；通过镜检发现小球藻有可能被其他藻类污染出现大面积死亡，从而导致轮虫生存环境受胁，说明实验过程中培养液易被污染，以后再做此类实验时尽可能保持无菌环境，生长培育实验还需要进一步进行。
参考文献：
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作者简介：
段江南（1993—），男，学士，就读院校：青海大学。
杨希（1983-），通讯作者，博士，讲师，主要研究方向：水生生物学。
基金项目：青海大学生态环境工程学院大学生科技创新项目（2016-S-3）
