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张旻南
摘要：分子量内标是STR分型时用来标定样品峰大小的重要内参，目前常用的内标如ABI公司LIZ500等都是采用PCR扩增的方法制备，这种方法制备的内标，由于引物二聚体的长度与内标中的小片段长度相近，不易于纯化，因此混有引物峰，容易在数据分析时产生误判，且不易于规模化生产。本实验采用定点突变技术结合酶切PCR产物的方法，制备了从50bp到500bp共14个片段的分子量内标，制备的产物没有引物峰等杂峰，且制备工艺适用于规模化生产，对获得的内标片段进行线性化分析，R值=0.9999，符合线性化要求，可以用作STR分型的分子量内标。
关键词：定点突变；酶切；分子量内标
0 引言
分子量内标是在进行STR检测时与样品在同一通道电泳的一系列长度不同的
DNA片段，在数据分析时，通过分析样品DNA与分子量内标的相对出峰位置，就可以标定样品DNA的大小。在电泳时，分子量内标的出峰时间和峰型也可以反映电泳仪器的工作状态。目前常用的分子量内标，如ABI公司的LIZ500，采用的直接PCR扩增的方法制备，得到的产物无法消除引物峰，且由于采用不同引物扩增，不同片段的扩增效率也有差异，这些问题导致其制备工艺不易于规模化生产。本实验利用定点突变技术把限制性内切酶位点引入同一DNA片段的不同位置，获得一系列突变位置不同的重组质粒。然后采用同一对引物扩增重组质粒，扩增效率相同，扩增后的产物经纯化后可以完全去除引物DNA，经酶切后的片段峰高易于调平。本实验制备的分子量内标中没有引物峰等杂峰的影响，峰型良好，线性化分析R值=0.9999，可以作为STR分型的分子量内标。
1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器
1.1.1 实验材料与试剂
9947DNA，GO taq PCR mix，EcoR V限制性内切酶（NEB公司），DpnI限制性内切酶，Qiagen DNA纯化试剂盒，Qiagen DNA质粒提取试剂盒，T载体（TAKARA），DH5α感受态细胞，定点突变试剂盒
1.1.2 实验仪器
GA118-16A，PCR扩增仪（ABI Pro Flex PCR系统），六一平板电泳仪，离心机（effendorf）。
1.2 实验方案
1.2.1 引物的设计
从Genebank上查找并下载人类基因组全序列，从中选取一段长度500bp的序列。这段序列要求碱基含量均衡，没有poly结构、回文结构等特殊序列，使用primer5.0设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：
F： TTCAAGTCAGGGTTTCCAAG
R： TTTTAGAGATAAGGTGTGCGT
其中，引物F的5端采用6FAM荧光标记，命名为F-FAM。
1.2.2 目的片段的扩增与重组质粒的获得
（1）以9947DNA为模板，F、R为引物，采用GO taq PCR mix进行扩增。其中，GO taq PCR mix 12.5μl；9947DNA 1μl（浓度1ng/μl）；引物F、R各1μl（浓度10μM）；双蒸水9.5μl。扩增程序：预变性95℃，5min；95℃，30s；57℃，40s；72℃，30s；40个循环；终延伸72℃，10min。
（2）采用Qiagen DNA纯化试剂盒对上步中扩增得到的片段进行纯化，纯化步骤详见试剂盒说明书。
（3）将纯化得到的目的片段连接到T载体，转化到DH5α感受态细胞，铺板并挑斑扩大培养（步骤详见T载体说明书）。
（4）采用Qiagen DNA质粒提取试剂盒参照试剂盒说明书提取质粒，并测序。测序的序列与Genebank上选取的序列进行比对，要求没有发生任何突变，将此质粒命名为质粒A。
1.2.3 突变质粒的获得
按照定点突变试剂盒说明书的操作步骤，在质粒A的50bp，75bp，100bp，139bp，150bp，160bp，200bp，250bp，300bp，350bp，400bp，450bp，490bp位點分别进行定点突变，引入EcoR V限制性内切酶酶切位点GAT^ATC，得到质粒A-50，A-75，A-100，A-139，A-150，A-160，A-200，A-250，A-300，A-350，A-400，A-450，A-490。经测序验证，引入的突变位点序列正确。
1.2.4 荧光片段的扩增与酶切
（1）以上一步获得的突变质粒为模板，采用GO taq PCR mix进行扩增，其中GO taq PCR mix 12.5μl；9947DNA 1μl（浓度1ng/μl）；引物F、R各1μl（浓度10μM）；双蒸水9.5μl。扩增程序：预变性95℃，5min；95℃，30s；57℃，40s；72℃，30s；40个循环；终延伸72℃，10min。
（2）采用Qiagen DNA纯化试剂盒对上步中扩增得到的片段进行纯化，纯化步骤详见试剂盒说明书。
（3）将上步中纯化后的产物分别用EcoR V限制性内切酶进行酶切，酶切体系：
DNA 1ug，EcoR V酶 1μl，10X buffber 2μl，双蒸水补足10μl。酶切反应条件：30℃孵育30min；65℃灭活20min.。
1.2.5 荧光片段的混合与检测
将上步酶切得到的片段按一定比例混合，取1μl混合产物与9μl甲酰胺混合，
95℃变性3分钟，立即置于冰上，在ABI3130上进行检测，进样电压1kV，进样时间15s，电泳电压15kV，电泳时间1500s。
2 结果与分析
分子量内标经ABI3130检测，结果如图1所示，峰型完好，没有引物峰及其他杂峰，各片段峰高均衡。经Genenmappper软件分析，各个片段大小判定正确。
对各个片段的出峰位置和片段大小进行线性分析，R值=0.9999，如图2所示。
本实验利用定点突变技术把限制性内切酶位点引入同一DNA片段的不同位置，获得一系列突变位置不同的重组质粒。各重组质粒除了酶切位点的位置不同，其他序列完全一致，因此可以采用同一对引物进行扩增，扩增效率相同。扩增后的片段都是500bp，通过纯化可以完全除去引物及引物二聚体。不同重组质粒的扩增产物含有同一个酶切位点，可以通过一次酶切反应得到长度不同的酶切产物。
本实验制备的分子量内标中没有引物峰等杂峰的影响，峰型良好，线性化分析R值=0.9999，可以作为STR分型的分子量内标。
本实验方案易于规模化生产，制作的分子量内标可以完全取代ABI LIZ500作为GA118系列遗传分析仪的性能检验试剂。
参考文献：
[1]雒丽娜.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变研究[J].安徽农业科学，2012
[2]张浩.定点突变技术的研究进展[J].免疫学杂志，2000endprint
